激光扫描共聚焦显微镜系统

激光扫描共聚焦显微镜系统

激光扫描共聚焦显微镜系统
激光扫描共聚焦显微镜（Laser scanning Confocal Microscopy ，简称LSCM）是近代生物医学图象仪器的最重要发展之一，它是在荧光显微镜成象的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激发荧光探针，利用计算机进行图象处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象，以及在亚细胞水平上观察诸如Ca2+、pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化。已广泛应用于细胞生物学、生理学、病理学、解剖学、胚胎学、免疫学和神经生物学等领域[1、2、3]，对生物样品进行定性、定量、定时和定位研究具有很大的优越性，为这些领域新一代强有力的研究工具。
  激光扫描共聚焦显微镜是近十年发展起来的医学图象分析仪器，现已广泛应用于荧光定量测量、共焦图象分析、三维图象重建、活细胞动力学参数监测和胞间通讯研究等方面。其性能为普遍光学显微镜质的飞跃，是电子显微镜的一个补充。本文以美国Meridian公司的ACAS ULTIMA312为例简要介绍了激光扫描共聚显微镜系统的结构，功能和生物学应用前景。

创建于1983年的美国Meridian公司，在90年代推出的“激光扫描共聚焦显微镜”这一项具有划时代的义意的高科技产品，曾获得美国“政府新产品奖”和两次“高科技领先技术奖”，它能达到每秒120幅画面的高速扫描激光共聚焦观察，可提供实时，真彩色的激光共聚焦原色图象。我院最近引起的ACAS uLTIMA312是Meridian公司最新的高科技产品，为同类仪器中档次最高、功能最全的精密仪器。现以该仪器为例介绍激光扫描共聚焦显微镜系统及其在细胞生物学中的应用。

1、激光扫描共聚焦显微镜成像原理及组成

有关共聚焦显微镜的某些技术原理，早在1957年就已提出，二十年后由Brandengoff在高数值孔径透镜装置上改装成功具有高清晰度的共聚焦显微镜[5]，1985年Wijnaendts Van Resandt发表了第一篇有关激光扫描共聚焦显微镜在生物学中应用的文章，到了1987年，才发展成现在通常意义上的第一代激光扫描共聚焦显微镜。

激光扫描共聚焦显微镜成像原理如图1所示，激光器发出的激光束经过扩束透镜和光束整形镜，变成一束直径较大的平行光束，长通分色反射镜使光束偏转90度，经过物镜会聚在物镜的焦点上，样品中的荧光物质在激光的激发下发射沿各个方向的荧光，一部分荧光经过物镜、长通分色反射镜、聚焦透镜、会聚在聚焦物镜的焦点处，再通过焦点处的针孔，由检测器接收。

从图1中可以看出，只有在物镜的焦平面上发出的荧光才够到达检测器，其它位置发出的光均不能过针孔。由于物镜和会聚透镜的焦点在同一光轴上，因而称这种方式成像的显微镜为共聚焦显微镜为共聚显微镜。在成像过程中针孔起着关键作用，针孔直径的大小不仅决定是以共聚焦扫描方式成像还是以普遍学显微镜扫描方式成像，而且对图像的对比度和分辨率有重要的影响。

ACAS ULTIMa 312采用快速镜扫描或台阶扫描对样品逐点扫描成像，由于样品中不同的扫描点始终在物镜和会聚透镜的光轴上，因而它以相同的信噪比扫描整个样品，扫描精度达0.1μm，扫描面积最大的为10cm×8cm，当激光逐点扫描样品时，针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，并将之转化为数字信号传输至计算机，最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚聚焦图像。一个微动步进马达控制栽物台的升降，使焦平面依次位于标本的不同层面上，可以逐层获得标本相应的光学横断面的图像。这称为“光学切片”。再利用计算机的图像处理及三维重建软件。可以得到高清晰度来表现标本的外形剖面，十分灵活、直观地进行形态学观察。

2、激光扫描共聚焦显微镜硬件和软件系统

2.1 ACAS ULTIMa 312硬件及参数指标　　激光光源：氩离子激光（50mW的紫外光、999 mW的可见光），能同时/顺序/分别输出紫外光和可见光，激发波长为351-364nm；488nm；514nm。　　计算机系统：80586/133MHz PCI/80MB RAM/2000MB SCSI硬盘/150MB Bernoulli盘驱动器/17’’大屏幕显示器。　　共聚焦系统：计算机自动控制光路准调节；计算机控制孔径校准；计算机调节孔径大小；自动Z轴调节（最小0.1μm）。　　光学探测系统：3个测窗式PMT采集荧光；1个CCD系统；12位的高速A/D转换器。　　图像分辨率：图像大小1535×1535；像素最小距离：0.1μm；灰度为4096级。　　扫描方式：快速镜扫描Dual Scan台阶扫描；扫描精度0.1μm；扫描面积最大为10cm×8cm ；扫描平面：XY和XZ和独特点、线、面扫描。2.2激光扫描共聚焦显微镜软件系统

ACAS ULTIMa 312系统采用独特设计的软件将激光细胞仪与先进的计算机技术结合，产生快速、高效、灵活的操作系统，完备的数据采集、分析与管理功能。基于生物医学研究有如下的软件。

Image Analyze?对于单色、比色和三色标记的二维荧光图像的定量分析，可产生透射光图像重叠，同时Auto Image可多个区域的自动扫描和荧光定量，以及相同区域的时间顺序扫描。　　Ratio Analysis和 Kinetics?测定细胞内的离子变化，可有点扫描、线扫描及图像扫描三种测定形式，以监测各种速率的生物反应。　　Cell ?Cell Communication and FRAP-相邻细胞的FRAP分析。该软件首先用可光淬灭特异的细胞荧光，然后在多个时间点扫描，此扫描可对单一区域或细胞的多个选择区域，可产生透射光图像并与其它图像重叠。　　Cell List?储存被选择细胞的位置，即可自动对较大样品进行扫描，又可产生较小样品特异部位的网络位置表，以进行自动的测量、筛选和重复测定。　　Cell Sorting?ACAS具备如下四种分选方式：　　Ablation Sort:预选定义一个荧光阈值 ，然后对特定细胞杀伤。②CookieCutter Sort在用户定义的中心点四周切割Cookies。③Quick Sort：对已定义的细胞表列，用Ablation或Cookie Cutter作分选。④Manual Sort：直接使用鼠标控制载物台位置及激光脉冲，并杀灭和分选细胞，进行细胞显微外科，染色体切割和光隐阱等操作。　　Confocal Imaging?共聚焦分析，可实现Z轴定量，三维立体图像分析（包括SFP模拟荧光处理法，DP深度投影法和SP文体投影法），以及视点移动动画。