倒置显微镜进行原生质体诱变选育冬虫夏草优良菌种

倒置显微镜进行原生质体诱变选育冬虫夏草优良菌种

内    容：
一、实验目的
掌握用工具酶制备原生质体的技术，并采用诱变的方法筛选出高产菌株。掌握原生质体的分离、培养方法，并对分离结果进行观察。
二、实验原理
    处在一定生长时期内的冬虫夏草菌丝体细胞壁，易被复合酶降解。由此能够制备大量冬虫夏草原生质体。原生质体因为缺乏细胞壁的保护，容易受诱变剂NTG的作用，从而产生大量的变异菌株。通过对这些变异菌株进行筛选，得到高产菌株。
三、试剂与器材
1.材料：Cordyceps militaris 菌种
2.试剂：溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶、马铃薯培养基（PDA）、渗透压稳定剂、 NTG溶液
3.实验器材：镊子接种针血球计数板、试剂瓶、三角瓶、移液管、具塞小试管、培养皿、酒精灯、超净工作台、灭菌锅、倒置显微镜、电子天平、摇床恒温培养箱、高速离心机、真空冻干机
四、实验内容
原生质体制备条件探索（复合酶组合及用量、酶作用时间、渗透压稳定剂、最适菌龄）→得出制备冬虫夏草原生质体的最佳条件组合→大量制备原生质体→800r/min离心2min去残余的菌丝碎片→3000r/min离心10min弃上清→渗透压稳定剂洗涤→离心两次悬于渗透压稳定剂→血球计数板计数→采用不同浓度的NTG溶液和不同作用时间组合诱变→诱变后的3000r/min离心10min→渗透压稳定剂洗2次→悬于渗透压稳定剂→加入到100ml/250ml的再生液体培养基中再生→吸取少量菌悬液涂布平板→培养2天后挑取单菌落→液体培养基中扩大培养→将培养5天的菌悬液4000r/min离心15min收集菌丝体→冻干→测甘露醇含量。
五、关键步骤及注意事项
1. 清洗时注意勿使原生质体浮起。无菌操作。
六、思考题
1.怎么保证所筛选高产菌株的特性稳定遗传？
2.本设计试验的有什么实际应用意义？