显微镜进行免疫组织化学实验

显微镜进行免疫组织化学实验

显微镜进行免疫组织化学实验
内　　容：
一、目的：
掌握免疫组织化学染色的基本技术及其用途，免疫组化主要应用于检测蛋白质在组织或细胞表面的表达情况。
二、原理：
免疫组织化学技术是用标记物或显色物标记的抗体检测细胞和组织内的抗原，从而达到诊断和研究疾病的目的。抗原的准确显示和定位与制备

的细胞和组织标本质量的好坏有着密切的联系。
三、试剂与器材：
    石腊包埋常规用具、切片机、显微镜、染色缸、湿盒、解剖器械、平皿、加样器等。
四、方法：
1、4%多聚甲醛常规灌注固定，取材并置20%蔗糖溶液（4℃）中过夜。蜡块制作。切片，贴片。0.01MKPBS清洗5min×3后；
2、加入配好的0.3%的过氧化氢甲醇溶液（甲醇80ml＋0.01MKPBS 100ml＋30%过氧化氢）30min，以消除内源性过氧化物酶的影响，0.01MPBS清

洗5min×3；
3、加入配好的0.3% Triton X100（30% Triton X100＋0.01MKPBS 100ml）30min，以增加细胞的通透性，0.01MKPBS清洗5min×3；
4、加入用血清稀释液（牛血清白蛋白1.00g＋0.01MPBS 100ml＋叠氮纳0.08g）稀释的一抗，4℃存放24-48h；吸去抗体，0.01MKPBS洗5min×3

；
5、加入0.01MKPBS稀释的的二抗，室温孵育2h。0.01MKPBS洗5min×3；
6、加入ABC复合物之类的抗体，室温孵育2h，0.01MKPBS洗5min×3；蒸馏水迅速冲三次；
7、加入显色液，进行免疫组织化学显色，时间一般不超过30min，可不时在显微镜下进行观察，待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液

，用蒸馏水迅速冲三次后加入0.01MKPBS终止反应；
14、梯度酒精脱水之后，封片，拍照。
五、关键步骤与注意事项：
1、尽量使用原液
2、用鼠抗人单克隆抗体
3、如要抗原修复应使用
4、DAB显色时间要控制好
5、复染时间不能太长
6、 标本固定时间要恰当
六、思考题：
1、免疫组化没有任何着色，试解释其原因。
2、免疫组化出现脱片怎么办？